优利科(上海)生命科学有限公司 15021281375
Close 公司首页 公司介绍 公司动态 产品展厅 证书荣誉 联系方式 在线留言
公司动态

弓形虫(TOX)PCR检测试剂盒说明书

发表时间:2024-11-06
【产品名称】
商品名称:弓形虫 (TOX)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name :Toxoplasma gondii Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人畜共患病,人及动物为该病的中间宿主,猫为其终极宿主。该病广泛分布于世界各地,严重危害人和动物的健康,我国将其列为二类动物疫病。弓形虫常引起动物发热、呼吸困难、神经症状及极度虚弱,有点还表现咳嗽、鼻有分泌物、口吐泡沫、发抖、摇头、脱水和腹泻,    母畜发病则引起流产,给各地畜牧业造成了很大损失。目前还没有理想的治疗弓形虫的药物和疫苗,及时诊断并作出预防是控制该病的有效措施。实时荧光 PCR 技术由于高灵敏、高特异、及时检测等特点,成为弓形虫病检测的发展趋势[1-3]。
本试剂盒适用于检测血液、脑脊液、肝、脾、肾、可疑食物等样本中的弓形虫,用于弓形虫感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采对弓形虫基因组设计特异性的引物和探针,用荧光 PCR 技术对弓形虫的核 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 50T/盒
TOX 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
TOX 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
无菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管;有神经系统症状的,动物或病人取脑脊液进行检测;疑似污染的食物取 1g 进行检测
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
固体样本:手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;液体样本:直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;脑脊液直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;血液样本:抗凝血离心取中层白细胞 50μL,加入
100μL 双蒸水吹匀
1.2 核酸提取
推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取试剂(离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说    明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 TOX 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。
3. 加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 2min
2 45 cycles 95℃ 15sec
60℃ 30sec
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)
反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数器,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤40,且有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行;
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3. 反应液应避光保存;
4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 王频佳, 张德纯. 荧光定量 PCR 检测弓形虫基因方法的建立[J].临床检验杂志, 2005, 23(2): 123-125.
[2] 彭武丽, 季新成, 史茜, 等. 实时荧光定量 PCR 检测弓形虫 GRA6 基因方法的建立和应用[J]. 新疆农业科学, 2014.
[3] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 18448.2-2008 实验动物-弓形虫检测方法[S]. 北京:科学出版社, 2008.

联系方式
手机:15021281375
Q Q: