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弓形虫（TOX）PCR检测试剂盒说明书

发表时间：2024-11-06

【产品名称】
商品名称：弓形虫 (TOX）核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法）
Name ：Toxoplasma gondii Detection Kit (Real-Time PCR Method）
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的人畜共患病，人及动物为该病的中间宿主，猫为其终极宿主。该病广泛分布于世界各地，严重危害人和动物的健康，我国将其列为二类动物疫病。弓形虫常引起动物发热、呼吸困难、神经症状及极度虚弱，有点还表现咳嗽、鼻有分泌物、口吐泡沫、发抖、摇头、脱水和腹泻，母畜发病则引起流产，给各地畜牧业造成了很大损失。目前还没有理想的治疗弓形虫的药物和疫苗，及时诊断并作出预防是控制该病的有效措施。实时荧光 PCR 技术由于高灵敏、高特异、及时检测等特点，成为弓形虫病检测的发展趋势[1-3]。
本试剂盒适用于检测血液、脑脊液、肝、脾、肾、可疑食物等样本中的弓形虫，用于弓形虫感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采对弓形虫基因组设计特异性的引物和探针，用荧光 PCR 技术对弓形虫的核 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 50T/盒
TOX 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
TOX 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
无菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管；有神经系统症状的，动物或病人取脑脊液进行检测；疑似污染的食物取 1g 进行检测
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
固体样本：手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；液体样本：直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；脑脊液直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；血液样本：抗凝血离心取中层白细胞 50μL，加入
100μL 双蒸水吹匀
1.2 核酸提取
推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
试剂 TOX 反应液酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤循环数温度时间收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 2min 否
2 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数器，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且有明显的指数增长曲线；阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 王频佳, 张德纯. 荧光定量 PCR 检测弓形虫基因方法的建立[J].临床检验杂志, 2005, 23(2）: 123-125.
[2] 彭武丽, 季新成, 史茜, 等. 实时荧光定量 PCR 检测弓形虫 GRA6 基因方法的建立和应用[J]. 新疆农业科学, 2014.
[3] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 18448.2-2008 实验动物-弓形虫检测方法[S]. 北京：科学出版社, 2008.