呋喃它酮代谢物检测试剂盒使用说明书

（酶联免疫法）

5.3.1 牛奶样本处理方法
1）取5ml样本于离心管中，加250ul 亚硝基铁氰化钾溶液（配液1）振荡混合30秒，加250ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；
2）取上清1.1ml，加4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；
3）在37℃过夜孵育(约16小时)或50℃（超过50℃时会影响分层效果）水浴孵育3小时；
4）分别加入5ml 0.1M K2HPO4 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振荡5分钟；
5）室温下4000转/分，离心10分钟； 
6）取出2.5ml的上层液到另一个离心管中，50-60℃氮气或空气吹干；
7）用1ml正已烷溶解残留物，加入1ml复溶工作液充分振荡混合30秒；室温4000转/分，离心10分钟；
8）去除上层正已烷，取50μl下层液用于分析。
    样本稀释倍数为2    检测下限：0.1ppb
5.3.2 奶粉、蛋粉样本处理方法
1）称取1±0.05g均质样于离心管中，加入4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；
2）在37℃过夜孵育(约16小时)或50℃（超过50℃时会影响分层效果）水浴孵育3小时；
3）加250ul 亚硝基铁氰化钾溶液（配液1）振荡混合30秒，加250ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；
4）取全部上清到另一个离心管中，后续接“5.3.1 牛奶样本处理方法，4）”
5.3.3 蜂蜜、组织、肠衣、肝脏、鸡蛋样本处理方法
1）称取1±0.05g均质样于离心管中，加入4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；
2）后续接“5.3.1 牛奶样本处理方法，3）”
5.3.4 熟食样本处理方法
1）称取1±0.05g均质样于50ml离心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去离子水，振荡2min，室温4000转/分，离心5分钟，去除全部液体；
2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振荡2min，室温4000转/分，离心5分钟，去除全部液体；
3）在沉淀中加入4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；
    注：熟食的添加回收试验请在此步加入高标准。
4）后续接“5.3.1 牛奶样本处理方法，3）”
6 酶联免疫试验步骤
    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μl/孔，再加入50μl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。
6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250μl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 显    色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。
6.5 终    止：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。