【产品名称】
商品名称：口蹄疫病毒 O 型(FMDV-O)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name ：Foot-and-mouth Disease Virus Type O Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
口蹄疫病是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth Disease Virus, FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国农业部公布的一类动物疫病。牛，猪最易感染 FMDV，羊、骆驼、象等均有发/病报告。该病可分为 O、A、C、南非 I 型、南非 II 型、南 III 型和亚洲 I 型等血清型，其中以 O 型和 A 型分布最广，危害 。
本试剂盒适用于检测样本中 O 型口蹄疫病毒 RNA，适用于 O 型口蹄疫病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒对 O 型口蹄疫病毒基因保守区设计特异性引物和探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对 O 型口蹄疫病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 50T/盒
FMDV-O 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
FMDV-O 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀动物，取淋巴结、脊髓、扁桃体、心/脏肌肉、骨胳肌等组织和水泡皮、水泡液；待检活动物，采   集动物血液 5ml 至无菌离心管，反刍动物可取 O/P 液 2~3mL。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
组织样本：将采集的动物机体组织，置组织匀浆器中充分研磨，加入青霉素 1 000 IU/mL、链/霉/素 500 IU/mL，
0.04 mol/L PBS(pH 7.4)制成 1:5 的组织悬液，4℃浸毒过夜。次日以 3000 r/min 离心 10 min，取上清液备用；水泡皮样品：称取水泡皮0.5g 于研磨器中研磨，加入生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；水泡液样品，以 3000 r/min 离心 10 min，取上清液备用； OP 液：将 O-P 液倒入灭菌塑料离心管内，再加入不少于样品 1/3 体积量的三氯三氣乙烧或氯/仿。用高速组织匀浆机以 10 000 r/min 搅拌 3 min，然后以 3 000 r/min 离心 10min，此时液体分成两相，将上层水相分装入样品保存管中备用。
1.2 核酸提取
推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明    书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 FMDV-O 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycle 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会. GB/T 18935-2018 口蹄疫诊断技术
[S].