【产品名称】
商品名称：猪蓝耳病病毒通用型（PRRSV-U）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ：Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS），又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的高度接触性传染病，我国列为二类传染病。该病的主要临床特征为：厌/食，发热，母猪 流/产、产死/胎、产弱胎和木乃伊胎以及各种年龄猪呼/吸/困/难。根据基因型和抗原性的差异，PRRSV 通常被分为欧洲型和美洲型，我国主要流行的是美洲型 PRRSV，但近几年我国多地区也相继分离到欧洲型 PRRSV。
本试剂盒适用于检测肺、扁桃体和口腔拭子、全血等标本中猪蓝耳病病毒 RNA，适用于猪蓝耳病病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒用一对猪蓝耳病病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪蓝耳病病毒的 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 50T/盒
PRRSV-U 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
PRRSV-U 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀猪，取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾/脏等组织；待检活猪，取口腔拭子或取血 5mL；公猪可采集精/液。
血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静/脉血不少于 5mL，置于无菌离心管内，2000r/min~3000r/min 离
心 10min，吸取上清液到新的离心管内备用。公猪精/液：按照 GB/T25172-2020 的方法采集和保存精/液。口腔拭子：大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，用采样拭子蘸取口腔分泌物，放入无菌采样管中。肺灌洗液：完    整摘取肺脏/肺叶，送实验室进行灌洗。组织样品：取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾/脏等组织，置于无菌离心管内备用。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
血清和精/液样品：无需进行前处理，直接用于核酸提取；口腔拭子样品：加入 500μL 无菌 PBS，充分涡旋震荡 1min，反复挤压拭子，弃去拭子后 3000r/min 离心 5min，取上清用于后续的核酸提取。肺灌洗液：根据肺脏/肺叶的大小，通过肺管加入 5mL~10mL 无菌 PBS，反复揉捏，吸取灌洗液，3000r/min 离心 5 min，取上清用于核酸提取。组织样品：取 1g 组织，剪碎，加人 2mL 生理盐水进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min 离心 5min， 取上清用于后续的核酸提取。
1.2 核酸提取
推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请    按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
试剂 PRRSV-U 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 35912-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光 RT-PCR 检测方法[S].
[2] 国家市场监督管理总局. GB/T 25172-2020 猪常温精液生产与保存技术规范[S].